فناوری پپتید FRET

انتقال انرژی رزونانس فلورسانس (FRET)

انتقال انرژی تشدید فلورسانس (FRET) یک فرآیند انتقال انرژی غیر تابشی است که در آن انرژی حالت برانگیخته دهنده از طریق تعامل زوج های الکتریکی بین مولکولی به حالت برانگیخته گیرنده منتقل می شود.این فرآیند شامل فوتون نمی شود و بنابراین غیر تابشی است.این آزمایش دارای مزایای سریع، حساس و ساده است.

رنگ مورد استفاده در سنجش FRET می تواند یکسان باشد.اما در بیشتر کاربردها، در واقع از رنگ های مختلف استفاده می شود.به طور خلاصه، انتقال انرژی تشدید نورانی، انتقال یک جفت دوقطبی از دهنده (رنگ 1) به گیرنده (رنگ 2) زمانی است که گروه دهنده برانگیخته می شود.به طور کلی، طیف انتشار گروه فلوروفور دهنده با طیف جذبی گروه گیرنده همپوشانی دارد.هنگامی که فاصله بین دو فلوروفور مناسب باشد (10-100 A)، انتقال انرژی فلوروفور از دهنده به گیرنده قابل مشاهده است.روش انتقال انرژی به ساختار شیمیایی گیرنده بستگی دارد:

1. تبدیل به ارتعاش مولکولی می شود، یعنی نور درخشان انتقال انرژی ناپدید می شود.(گیرنده خاموش کننده نور است)

2. انتشار شدیدتر از خود گیرنده است و در نتیجه طیف فلورسانس ثانویه به قرمز منتقل می شود.(گیرنده ها ساطع کننده های نورانی هستند).

گروه دهنده (EDANS) و ژن گیرنده (DABCYL) به طور یکنواخت با سوبسترای طبیعی پروتئاز HIV مرتبط هستند و زمانی که بستر قطع نشده باشد، DABCYL می تواند EDANS را خاموش کند و سپس برای فلوئور غیرقابل تشخیص شود.پس از قطع ارتباط پروتئاز HIV-1، EDANS دیگر توسط DABCYL خاموش نمی شود و EDANS لوسیفرازها متعاقباً قابل تشخیص هستند.در دسترس بودن مهارکننده های پروتئاز را می توان با تغییرات در شدت فلورسانس EDANS کنترل کرد.

پپتیدهای FRET ابزار مناسبی برای مطالعه غیر اختصاصی بودن پپتیداز هستند.از آنجایی که فرآیند واکنش آن می تواند به طور مداوم نظارت شود، روش مناسبی برای تشخیص فعالیت آنزیم ارائه می دهد.جلای تولید شده پس از هیدرولیز پیوندهای پپتیدی توسط دهنده/گیرنده، معیاری از فعالیت آنزیم در غلظت های نانومولار را فراهم می کند.هنگامی که پپتید FRET دست نخورده است، ناپدید شدن ناگهانی فلاش داخلی را نشان می دهد، اما هنگامی که هر پیوند پپتیدی در مقابل دهنده/گیرنده شکسته می شود، فلاش آزاد می کند که می تواند به طور مداوم شناسایی شود و سپس فعالیت آنزیم می تواند کمیت شود.